|
|
Complementary analysis of procaryotic cells by electron microscopy and Raman spectroscopy
Ikrényiová, Terézia ; Sedláček, Petr (referee) ; Hrubanová, Kamila (advisor)
This master thesis deals with conventional methods of bacterial cell analysis, polyhydroxyalkanoates, Raman spectroscopy and electron microscopy in the theoretical part. The production of polyhydroxybutyrate by selected thermophilic bacteria and their analysis by gas chromatography, cryogenic scanning electron microscopy and Raman spectroscopy is described in the experimental part. The chosen sample was analyzed by a transmission electron microscope. Comparing the results from previous mentioned methods it was found that the bacteria Schlegelella thermodepolymerans accumulated the highest amount of PHB. The lowest amount of PHB was obtained by bacteria Rubrobacter xylanophilus. The assumption that the PHB granules formed so-called needle-like plastic deformations during freeze-fracturing was affirmed by cryo-SEM photos analysis. Moreover, it was found that the bacterial cell characterization deduced from microscopic observation of samples corresponded to the description in the literature. TEM provided better resolution photos and in consequence the cells and PHB are more visible. The thesis is also focused on chemical fingerprint analysis of cells by Raman spectroscopy. Several biomolecules were identified by measured Raman spectra for the particular samples.
|
|
|
Scanning Electron Microscopy and its Applications for Sensitive Samples
Hrubanová, Kamila ; Nováček, Jiří (referee) ; Schröfel,, Adam (referee) ; Krzyžánek, Vladislav (advisor)
Předložená dizertační práce s názvem “Rastrovací elektronová mikroskopie a její aplikace pro senzitivní vzorky” pojednává o problematice rastrovací elektronové mikroskopie v kontextu instrumentálního a metodologického vývoje vedoucího k inovativnímu řešení, které je dobře aplikovatelné zejména v mikrobiologickém výzkumu. Součástí práce je rozprava o historii a současném stavu elektronové mikroskopie (EM) jakožto vědecké zobrazovací a analytické techniky, tato část se nachází v úvodních kapitolách. Nepopiratelný přínos EM v biologických a lékařských oborech je dokazován mnoha citovanými vědeckými publikacemi. Předložená dizertační práce přináší novinky z oblasti přípravy preparátů a kryogenní rastrovací elektronové mikroskopie (cryo-SEM) vyvinuté na pracovišti Ústavu přístrojové techniky AV ČR, v.v.i. v Brně. Jedná se především o návrhy a výrobu speciálních držáků vzorků a vývoj nových metodik v oblasti přípravy mikrobiologických preparátů vedoucích k nalezení optimálních parametrů jednotlivých procesů. V experimentální části se nachází ověření metodologických postupů při studiu hydratovaných a na elektronový svazek senzitivních preparátů. Následné srovnání různých přístupů na definovaném biologickém systému z oblasti mikrobiologie přispívá k rozšíření interpretace doposud známých výsledků. Mezi zkoumanými mikrobiologickými kmeny byly biofilm-pozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis a kvasinky jako Candida albicans a Candida parapsilosis, jež jsou považovány za klinicky významné, protože se podílejí na vzniku závažných infekcí zejména u imunokompromitovaných pacientů. Dále byl studován vliv růstu biofilmu bakterie Bacillus subtilis na biodeteriorizaci a biodegradaci poly--kaprolaktonových fólií. Vývoj v oblasti cryo-SEM byl aplikován ve výzkumu mikrobů s biotechnologickým potenciálem, jako jsou např. Cupriavidus necator a Sporobolomyces shibatanus.
|
|
|
Quantitative Imaging in Scanning Electron Microscope
Skoupý, Radim ; Buršík, Jiří (referee) ; Shimoni, Eyal (referee) ; Krzyžánek, Vladislav (advisor)
Tato práce se zabývá možnostmi kvantitativního zobrazování ve skenovacím (transmisním) elektronovém mikroskopu (S|T|EM) společně s jejich korelativní aplikací. Práce začíná popisem metody kvantitativního STEM (qSTEM), kde lze stanovenou lokální tloušťku vzorku dát do spojitosti s ozářenou dávkou, a vytvořit tak studii úbytku hmoty. Tato metoda byla použita při studiu ultratenkých řezů zalévací epoxidové pryskyřice za různých podmínek (stáří, teplota, kontrastování, čištění pomocí plazmy, pokrytí uhlíkem, proud ve svazku). V rámci této části jsou diskutovány a demonstrovány možnosti kalibračního procesu detektoru, nezbytné pozadí Monte Carlo simulací elektronového rozptylu a dosažitelná přesnost metody. Metoda je pak rozšířena pro použití detektoru zpětně odražených elektronů (BSE), kde byla postulována, vyvinuta a testována nová kalibrační technika založená na odrazu primárního svazku na elektronovém zrcadle. Testovací vzorky byly různě tenké vrstvy v tloušťkách mezi 1 až 25 nm. Použití detektoru BSE přináší možnost měřit tloušťku nejen elektronově průhledných vzorků jako v případě qSTEM, ale také tenkých vrstev na substrátech - qBSE. Obě výše uvedené metody (qSTEM a qBSE) jsou založeny na intenzitě zaznamenaného obrazu, a to přináší komplikaci, protože vyžadují správnou kalibraci detektoru, kde jen malý posun úrovně základního signálu způsobí významnou změnu výsledků. Tato nedostatečnost byla překonána v případě qSTEM použitím nejpravděpodobnějšího úhlu rozptylu (zachyceného pixelovaným STEM detektorem), namísto integrální intenzity obrazu zachycené prstencovým segmentem detektoru STEM. Výhodou této metody je její použitelnost i na data, která nebyla předem zamýšlena pro využití qSTEM, protože pro aplikaci metody nejsou potřeba žádné zvláštní předchozí kroky. Nevýhodou je omezený rozsah detekovatelných tlouštěk vzorku způsobený absencí píku v závislosti signálu na úhlu rozptylu. Obecně platí, že oblast s malou tloušťkou je neměřitelná stejně tak jako tloušťka příliš silná (použitelný rozsah je pro latex 185 - 1 000 nm; rozsah je daný geometrií detekce a velikostí pixelů). Navíc jsou v práci prezentovány korelativní aplikace konvenčních a komerčně dostupných kvantitativních technik katodoluminiscence (CL) a rentgenové energiově disperzní spektroskopie (EDX) spolu s vysokorozlišovacími obrazy vytvořenými pomocí sekundárních a prošlých elektronů.
|
|
|
Characterization of Mechanical Properties of semi-IPN Hydrogels Based on Poly(vinylalcohol)
Přibyl, Jiří ; Pekař, Miloslav (referee) ; Kalina, Michal (advisor)
This diploma thesis deals with the issue of mechanical properties of semi-IPN hydrogels based on poly(vinylacohol). The prepared poly(vinylalcohol) hydrogels were modified by the addition of sodium alginate, dextran, DEAE-dextran, chitosan, and poly(ethyleneglycol). The mechanical properties were studied by various methods, such as the oscillatory amplitude rheological test, dynamic mechanical analysis, swelling experiments and drying characteristics. Microcalorimetry was used to study the interactions between poly(vinylalcohol) and biopolymers in solution using the ITC method and the morphology of prepared hydrogels was visualized using cryo-SEM. The main concept for semi-IPN hydrogels is that there is minimal influence on the mechanical properties but leads to the modification of the binding sites present in the hydrogel structure, which has a high potential in transport properties. From the experimental results, the effects of each biopolymer on the mechanical properties were determined. The obtained results showed that the additions of biopolymers do not have a significant impact on the mechanical properties of PVAl hydrogels, but in the case of swelling experiments, there is a significant influence of the number of freezing/thawing cycles, ionic strength of the environment, and the used biopolymer.
|
|
|
Complementary analysis of procaryotic cells by electron microscopy and Raman spectroscopy
Ikrényiová, Terézia ; Sedláček, Petr (referee) ; Hrubanová, Kamila (advisor)
This master thesis deals with conventional methods of bacterial cell analysis, polyhydroxyalkanoates, Raman spectroscopy and electron microscopy in the theoretical part. The production of polyhydroxybutyrate by selected thermophilic bacteria and their analysis by gas chromatography, cryogenic scanning electron microscopy and Raman spectroscopy is described in the experimental part. The chosen sample was analyzed by a transmission electron microscope. Comparing the results from previous mentioned methods it was found that the bacteria Schlegelella thermodepolymerans accumulated the highest amount of PHB. The lowest amount of PHB was obtained by bacteria Rubrobacter xylanophilus. The assumption that the PHB granules formed so-called needle-like plastic deformations during freeze-fracturing was affirmed by cryo-SEM photos analysis. Moreover, it was found that the bacterial cell characterization deduced from microscopic observation of samples corresponded to the description in the literature. TEM provided better resolution photos and in consequence the cells and PHB are more visible. The thesis is also focused on chemical fingerprint analysis of cells by Raman spectroscopy. Several biomolecules were identified by measured Raman spectra for the particular samples.
|
|
|
An appropriate method for assessing hydrogel pore sizes by cryo-sem
Adámková, Kateřina ; Trudicová, M. ; Hrubanová, Kamila ; Sedláček, P. ; Krzyžánek, Vladislav
The aim of our work was to examine and describe ultrastructure of the agarose hydrogel and any possible structural concentration dependencies, and to assess the distribution and size of pores of agarose hydrogel in dependence on its concentration. Four concentrations were prepared (0.5 %, 1.0 %, 2.0 % and 4.0 % of dry weight content) and cryo-SEM and turbidimetry methods were executed on wet (original) samples in order to image the ultrastructure and measure the pore sizes within. \nReasonable results were obtained for the wet samples as they were closer to their native state they are usually used for applications in. Cryo-SEM and turbidimetry provided comparable results of pore diameters and allowed to compare pore diameters dependant on the concentrations, moreover, it showed more detailed and realistic structure.
|
|
|
Quantitative Imaging in Scanning Electron Microscope
Skoupý, Radim ; Buršík, Jiří (referee) ; Shimoni, Eyal (referee) ; Krzyžánek, Vladislav (advisor)
Tato práce se zabývá možnostmi kvantitativního zobrazování ve skenovacím (transmisním) elektronovém mikroskopu (S|T|EM) společně s jejich korelativní aplikací. Práce začíná popisem metody kvantitativního STEM (qSTEM), kde lze stanovenou lokální tloušťku vzorku dát do spojitosti s ozářenou dávkou, a vytvořit tak studii úbytku hmoty. Tato metoda byla použita při studiu ultratenkých řezů zalévací epoxidové pryskyřice za různých podmínek (stáří, teplota, kontrastování, čištění pomocí plazmy, pokrytí uhlíkem, proud ve svazku). V rámci této části jsou diskutovány a demonstrovány možnosti kalibračního procesu detektoru, nezbytné pozadí Monte Carlo simulací elektronového rozptylu a dosažitelná přesnost metody. Metoda je pak rozšířena pro použití detektoru zpětně odražených elektronů (BSE), kde byla postulována, vyvinuta a testována nová kalibrační technika založená na odrazu primárního svazku na elektronovém zrcadle. Testovací vzorky byly různě tenké vrstvy v tloušťkách mezi 1 až 25 nm. Použití detektoru BSE přináší možnost měřit tloušťku nejen elektronově průhledných vzorků jako v případě qSTEM, ale také tenkých vrstev na substrátech - qBSE. Obě výše uvedené metody (qSTEM a qBSE) jsou založeny na intenzitě zaznamenaného obrazu, a to přináší komplikaci, protože vyžadují správnou kalibraci detektoru, kde jen malý posun úrovně základního signálu způsobí významnou změnu výsledků. Tato nedostatečnost byla překonána v případě qSTEM použitím nejpravděpodobnějšího úhlu rozptylu (zachyceného pixelovaným STEM detektorem), namísto integrální intenzity obrazu zachycené prstencovým segmentem detektoru STEM. Výhodou této metody je její použitelnost i na data, která nebyla předem zamýšlena pro využití qSTEM, protože pro aplikaci metody nejsou potřeba žádné zvláštní předchozí kroky. Nevýhodou je omezený rozsah detekovatelných tlouštěk vzorku způsobený absencí píku v závislosti signálu na úhlu rozptylu. Obecně platí, že oblast s malou tloušťkou je neměřitelná stejně tak jako tloušťka příliš silná (použitelný rozsah je pro latex 185 - 1 000 nm; rozsah je daný geometrií detekce a velikostí pixelů). Navíc jsou v práci prezentovány korelativní aplikace konvenčních a komerčně dostupných kvantitativních technik katodoluminiscence (CL) a rentgenové energiově disperzní spektroskopie (EDX) spolu s vysokorozlišovacími obrazy vytvořenými pomocí sekundárních a prošlých elektronů.
|
|
|
Scanning Electron Microscopy and its Applications for Sensitive Samples
Hrubanová, Kamila ; Nováček, Jiří (referee) ; Schröfel,, Adam (referee) ; Krzyžánek, Vladislav (advisor)
Předložená dizertační práce s názvem “Rastrovací elektronová mikroskopie a její aplikace pro senzitivní vzorky” pojednává o problematice rastrovací elektronové mikroskopie v kontextu instrumentálního a metodologického vývoje vedoucího k inovativnímu řešení, které je dobře aplikovatelné zejména v mikrobiologickém výzkumu. Součástí práce je rozprava o historii a současném stavu elektronové mikroskopie (EM) jakožto vědecké zobrazovací a analytické techniky, tato část se nachází v úvodních kapitolách. Nepopiratelný přínos EM v biologických a lékařských oborech je dokazován mnoha citovanými vědeckými publikacemi. Předložená dizertační práce přináší novinky z oblasti přípravy preparátů a kryogenní rastrovací elektronové mikroskopie (cryo-SEM) vyvinuté na pracovišti Ústavu přístrojové techniky AV ČR, v.v.i. v Brně. Jedná se především o návrhy a výrobu speciálních držáků vzorků a vývoj nových metodik v oblasti přípravy mikrobiologických preparátů vedoucích k nalezení optimálních parametrů jednotlivých procesů. V experimentální části se nachází ověření metodologických postupů při studiu hydratovaných a na elektronový svazek senzitivních preparátů. Následné srovnání různých přístupů na definovaném biologickém systému z oblasti mikrobiologie přispívá k rozšíření interpretace doposud známých výsledků. Mezi zkoumanými mikrobiologickými kmeny byly biofilm-pozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis a kvasinky jako Candida albicans a Candida parapsilosis, jež jsou považovány za klinicky významné, protože se podílejí na vzniku závažných infekcí zejména u imunokompromitovaných pacientů. Dále byl studován vliv růstu biofilmu bakterie Bacillus subtilis na biodeteriorizaci a biodegradaci poly--kaprolaktonových fólií. Vývoj v oblasti cryo-SEM byl aplikován ve výzkumu mikrobů s biotechnologickým potenciálem, jako jsou např. Cupriavidus necator a Sporobolomyces shibatanus.
|
|
|
Structure investigation of hydrogels using a cryo-SEM
Adámková, Kateřina ; Hrubanová, Kamila ; Samek, Ota ; Trudičová, M. ; Sedláček, P. ; Krzyžánek, Vladislav
Hydrogels can be characterized as elastic hydrophilic polymer chains connected in network\nwhich are able to swell notably when exposed to aqueous media by absorbing considerable\namounts of water. Besides being a constituent of living organisms, nowadays, there are\nvarious fields hydrated polymers (e.g. polyvinyl alcohol, collagen, and starch) can be utilized\n– in both biological and non-biological form. Classic examples of such applications are\nhuman health and cosmetics (contact lenses, wound healing dressings and artificial\nreplacement tissues – skin, arterial grafts, cornea and spinal disc replacement), pharmacy\n(drug delivery systems), bioengineering, food industry, agriculture etc. Also, hydrogels\ncan reversibly change their shape when being exposed to a temperature change.
|
|
|
Comparison of freeze fracture images of mixed bacterial/yeast biofilm in cryo-SEM with high pressure freezing fixation
Hrubanová, Kamila ; Nebesářová, Jana ; Růžička, F. ; Krzyžánek, Vladislav
Microscopic organisms include bacteria and yeasts have been studied in this project. Besides the planktonic way of living, microbes are able to adhere to surfaces or interfaces and to form organized communities, a so-called biofilm, which are embedded in a matrix of extracellular polymeric substances that they produce; visualization and quantification of this microscopic formation is the main goal of this study. In medicine the biofilm formation allows microorganisms to colonize the surface of implants and it also protects the microbial cells from attacks by the immunity system as well as from the effect of antibiotics. Therefore, the biofilm is considered to be important virulence factor in these microorganisms. The characteristic features of the biofilm infections, especially high resistance to antifungal agents, complicate therapy. Understanding of the biofilm structure can contribute to understanding the biofilmformation and basic biochemical mechanisms underlying this process. It may help to develop more efficient treatment strategy for biofilm infection.
|
guest ::
